Estudio de la sensibilidad in vitro de levaduras por el sistema ATB-Fungus

Estudio de la sensibilidad in vitro de levaduraspor el sistema ATB-Fungus

M.M. Martínez, P. Mendaza, R.M. Daza, G. Sánchez, P. Martín, J.E. Martín y F. Portero
Servicio de Microbiología, Hospital Universitario Clínica Puerta de Hierro, C/ San Martín de Porres nº 4, 28035 Madrid.

La creciente incidencia de infecciones por levaduras, el incremento de fármacos antifúngicos y la aparición de resistencias a éstos ha llevado a los laboratorios de microbiología clínica a la necesidad de conocer la sensibilidad antifúngica de sus aislamientos (1).

Los ensayos in vitro de sensibilidad antifúngica son problemáticos por los factores que pueden influir en su resultado, tales como el tipo de microorganismo, el tamaño del inóculo, el medio empleado, las condiciones de incubación y el método de lectura e interpretación (2-4).

Así mismo, la laboriosidad de los métodos de referencia propuestos por los NCCLS (5) para la realización de las pruebas de sensibilidad in vitro a los distintos antifúngicos hace difícil su incorporación a la rutina del laboratorio. Frente a estos métodos, la aplicación del sistema ATB-Fungus (bioMérieux, France) para la práctica clínica ha demostrado ser un método sencillo con una buena reproducibilidad (>95% según Druetta y cols.) (6) y un aceptable grado de correlación (7).

Hemos determinado la sensibilidad in vitro de 200 cepas de levaduras aisladas de distintas muestras clínicas entre junio de 1995 y junio de 1997. El procesamiento de las muestras y la identificación de los aislamientos se realizó por métodos micológicos convencionales. La caracterización bioquímica se llevó a cabo mediante el sistema de asimilación de azúcares API 20C Aux (bioMérieux, France). Se identificaron las siguientes especies: 109 Candida albicans (54,5%), 37 Candida tropicalis (18,5%), 25 Candida glabrata (12,5%), 10 Candida parapsilosis (5%), 9 Candida inconspicua (4,5%); y un 5% de otras especies distribuidas de la siguiente forma: 4 Candida lusitaniae, 2 Saccharomyces cerevisiae y una cepa de Blastoschizomyces capitatus, Candida kefyr, Candida lipolytica y Cryptococcus albidus, respectivamente. Tras la identificación se almacenaron hasta su estudio en tubo de Sabouraud cloranfenicol a temperatura ambiente.

La prueba de sensibilidad in vitro se realizó mediante el sistema ATB-Fungus, según las normas del fabricante, asegurando la estandarización, fiabilidad y reproducibilidad con la cepa patrón Saccaromyces cerevisiae ATCC 9763. Este método nos permite determinar la sensibilidad a la amfotericina a las concentraciones de 1, 2, 4 y 8 mg/l, y a la 5-fluorocitosina a las concentraciones de 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64 y 128 mg/l. La nistatina se presenta en dos concentraciones de 4 y 8 mg/l. Por último, el miconazol, el econazol y el ketoconazol se ensayan a las concentraciones de 1 y 8 mg/l.

La utilización de este sistema implica los siguientes pasos: estandarización del inóculo, que se facilita con un densitómetro, inoculación en la galería, lectura después de 48 horas de incubación a 30 °C basándose en la turbidez de los pocillos e interpretación de los resultados, considerándose una cepa resistente a la 5-fluorocitosina cuando se evidencia crecimiento similar al control con una concentración >32 mg/l y resistente a la amfotericina cuando ocurre esto a una concentración >4 mg/l. Para el resto de los antifúngicos, al existir dos concentraciones críticas, sólo se puede catalogar a las cepas como sensibles, intermedias o resistentes.

Tabla 1. Sensibilidad a los antifúngicos de 200 levaduras.

Antifúngico (concentración o categoría)	Número de cepas (%)
Amfotericina B <1 mg/l >1-4 mg/l >4 mg/l	185 (92,5) 13 (6,5) 2 (1)
5-Fluorocitosina <2 mg/l >2-32 mg/l >32 mg/l	127 (63,5) 51 (25,5) 22 (11,0)
Nistatina Sensible Intermedia	193 (96,5) 7 (3,5)
Miconazol Sensible Intermedia Resistente	77 (38,5) 107 (53,5) 16 (8,0)
Econazol Sensible Intermedia Resistente	72 (36) 123 (61,5) 5 (2,5)
Ketoconazol Sensible Intermedia Resistente	80 (40) 98 (49) 22 (11)

Los resultados de la evaluación de la sensibilidad in vitro de las levaduras estudiadas a los distintos antifúngicos se observan en la Tabla 1.

El sistema ATB-Fungus es un método de fácil manejo, al igual que otros existentes en el mercado, tales como Mycototal, Candifast, Mycostandard y Diff Test (6). Se basa en una microdilución ajustada a los puntos de corte (8), permitiendo una fácil lectura de los resultados.

La interpretación de los resultados para la amfotericina y la 5-fluorocitosina presenta la ventaja añadida de poder determinar la CMI. El 92,5% de las cepas son sensibles a la amfotericina con unos valores <1 mg/l, existiendo solamente un 1% de cepas resistentes con un punto de corte >4 mg/l. Frente a la 5-fluorocitosina el 63,5% de las cepas son sensibles con unos valores <2 mg/l. No encontramos en nuestro estudio ninguna cepa resistente a la nistatina, siendo el 96,5% sensibles, datos que coinciden con los de otros autores (9).

Al estudiar los azoles destaca el alto porcentaje de cepas con resistencia intermedia al miconazol (53,5%), al econazol (61,5%) y al ketoconazol (49%). Esto se debe, como ya precisaron Hugues y cols. (10) y Gordon y cols. (11), a que los azoles producen una inhibición parcial del crecimiento, lo que origina una ligera turbidez. Al ser difícil la diferenciación entre crecimiento residual (inferior al control) y crecimiento significativo aparece un problema de subjetividad de la lectura cuando ésta se realiza visualmente.

La especie más sensible a la amfotericina fue C. parapsilosis (100%), con unos valores de CMI <1 mg/l, y la más resistente C. glabrata (4%). Aunque sus valores de CMI son como los de la anterior, presenta un rango entre <1 y 8 mg/l.

La tasa de resistencia primaria a la 5-fluorocitosina parece depender de la especie de Candida estudiada, como refieren Quindós y cols. (9), que encuentran un 27% de los aislamientos de C. parapsilosis resistentes. En nuestro estudio la especie más resistente también fue C. parapsilosis (20%) y la más sensible C. glabrata (76%).

Por otra parte, C. parapsilosis es la especie más sensible a la nistatina, no advirtiéndose ninguna resistencia. En el caso de los azoles, las levaduras que presentan una mayor sensibilidad son las de la especie C. parapsilosis. En cambio, la resistencia se presenta más diversificada.

Creemos que se debería realizar pruebas de sensibilidad a todas las levaduras aisladas de muestras clínicas, siendo el ATB-Fungus una buena alternativa a los laboriosos métodos de referencia existentes, aunque cada laboratorio deberá buscar aquellos métodos que les resulten más adecuados a sus condiciones de trabajo.

BIBLIOGRAFÍA

1. Quindós, G., Lipperheide, V., Barturen, B. y cols. A new method of antibiotyping yeasts for subspecies discrimination and distribution in human clinical specimens. Eur J Epidemiol 1996; 12: 55-62.
2. Quindós, G., Salesa, R., Carrillo-Muñoz, A.J. y cols. Multicenter evaluation of ATB-Fungus: A standardized micromethod for yeasts susceptibility testing. Chemotherapy 1994; 40: 245-251.
3. Lozano, M.C., Parras, P., Martín, E. Evaluación de un nuevo sistema automatizado para la determinación de la sensibilidad a antifúngicos. Enf Infec Microbiol Clin 1993; 11: 135-138.
4. Rubio, M.C., Gil, J., Benito, R. Las pruebas in vitro en la evaluación de los agentes antifúngicos. Rev Esp Quimioterap 1993; 6: 21.
5. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts; Proposed Standard. NCCLS document M27-A. NCCLS, Villanova, PA, 1997.
6. Druetta, A., Freydiere, A., Guinet, R., Gille, Y. Evaluation of five commercial antifungal susceptibility testing systems. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1993; 12: 336-342.
7. De Montclos, M., De Montclos, H. Etude comparative de deux systèmes de détermination de la sensibilité des levures à quatre antifongiques. Path Biol 1992; 40: 495-499.
8. Pemán, J., Cantón, E. Las pruebas de sensibilidad antifúngica en un laboratorio de microbiología clínica. Rev Esp Quimioterap 1996; 9: 17-20.
9. Quindós, G., San Millán, R., Burgos, A., Lipperheide, V., Tellaetxe, M., Alonso, R. Evaluación de la sensibilidad a los antifúngicos de aislamientos clínicos de los serotipos A y B de Candida albicans mediante el método ATB-Fungus. Enf Infec Microbiol Clin 1995; 13: 209-212.
10. Hugues, C.E., Bennet, R.L., Beggs, W.H. Broth dilution testing of Candida albicans susceptibility to ketonazole. Antimicrob Agents Chemother 1987; 31: 643-646.
11. Gordon, M.A., Lapa, E.W., Passero, P. Improved method for azole antifungal susceptibility. J Clin Microbiol 1988; 26: 1874-1877.

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