Integrones. Nueva causa de resistencia a antibióticos

La transmisión de genes que confieren resistencia a determinados antibióticos entre diferentes especies bacterianas, especialmente en enterobacterias, es un problema siempre creciente en el ámbito de las enfermedades infecciosas, y más aún si nos referimos a infecciones nosocomiales. Muchos genes de resistencia se localizan en plásmidos y/o transposones, de forma que se pueden transferir fácilmente entre diferentes cepas y especies de bacterias. Recientemente se ha descrito otro mecanismo mediante el que estos genes pueden ser transmitidos. En este caso participan en el proceso unas piezas de material genético denominadas integrones.

Los integrones tienen la información genética necesaria para expresar una proteína implicada en la captura y liberación de ciertos elementos móviles IS (inserted sequences), en los que se incluyen los genes de resistencia a antibióticos. El proceso de integración de estos elementos se realiza mediante una recombinación genética específica de sitio. Además, los integrones tienen en su estructura al menos un promotor (P1) que permite la expresión de los genes insertados en su interior. En algunas ocasiones se puede encontrar un segundo promotor, en una zona cercana al primero, que incrementa el grado de transcripción y expresión de los genes.

ESTRUCTURA DEL INTEGRÓN

Los integrones están constituidos por dos regiones de DNA muy conservadas, situadas en sus extremos, que se denominan 5í CS y 3í CS (5í y 3í conserved segments). Entre estas dos zonas se pueden insertar uno o más genes de resistencia a antibióticos (Fig. 1). Éstos pueden ser muy variados y causar resistencia por diferentes mecanismos, como en el caso de los genes de resistencia a los aminoglucósidos, que son los más abundantes y da los que se han identificado tres familias diferentes, subdivididas a su vez en varios grupos. Cada uno de los genes de estas familias codifica para una proteína diferente (acetiltransferasas, nucleotidiltransferasas o fosfotransferasas). En el interior del integrón también se han encontrado genes de resistencia a trimetoprima, cloranfenicol y betalactámicos. Hasta el momento se han identificado más de 40 genes de resistencia que pueden incluirse en la estructura del integrón. Además existen fragmentos de lectura abierta (orf) cuya función no se conoce todavía y que también pueden representar genes de resistencia a otras clases de antibióticos.

EXTREMO 5í CS

Este segmento de DNA tiene una longitud de 1,36 kb (1, 2). Se caracteriza porque cuenta con un promotor, un gen int, que codifica para una integrasa o recombinasa encargada de catalizar una recombinación genética específica de sitio, y una zona attI que es uno de los lugares donde se insertan las IS.

En la hebra de DNA complementaria a la que codifica para la integrasa (y su promotor) se incluye al menos un promotor, necesario para que se expresen los genes de resistencia insertados entre las secuencias 3í y 5í CS, ya que la mayoría de estos genes no cuentan con sus propios promotores (3). En algunas ocasiones se observa en unión con este primer promotor (y nunca de forma aislada) un segundo promotor (4, 5), formado por la inserción de 3 residuos de G entre las secuencias -10 y -35 (6). De esta forma, mediante la acción de este segundo promotor, se puede incrementar la transcripción de los genes de las IS.

En el extremo 3í de la región 5í CS se encuentra una zona receptora (attI), donde pueden insertarse las IS. Tanto esta reacción de inserción como la de escisión están mediadas por la IntI (7, 8).

Los nuevos genes pueden provenir tanto de otros integrones que perderán el gen (9, 10) como de genes circulares aislados que se han separado previamente de un integrón (9). En cualquier caso, si la expresión del nuevo gen supone un beneficio para la bacteria, debido a que ésta se encuentra en un ambiente donde exista un determinado antibiótico frente al que el gen en cuestión confiere resistencia, la bacteria dispondrá de una ventaja selectiva que le permitirá desplazar a las demás.

EXTREMO 3í CS

El extremo 3í CS tiene una longitud de al menos 2 kb (1, 2) y la secuencia de esta zona se halla menos conservada entre los distintos integrones que la de la zona 5í CS. En este segmento se incluyen unos genes que dotan a la bacteria de resistencia a distintos compuestos, no sólo antibióticos. El gen qacEA1 es un determinante de resistencia a compuestos cuaternarios de amonio (11), como determinados antisépticos y desinfectantes. El gen sulI determina resistencia a las sulfonamidas. Después de éstos, se inserta un fragmento de lectura abierta (orf 5) cuya función se desconoce hasta el momento.

En algunos ocasiones se han detectado integrones que carecen de los genes qacEA1 y sulI en este extremo 3í CS. Varios autores han sugerido que podría tratarse de un integrón primitivo, a partir del cual han evolucionado los actuales, en los que dichos genes se insertaron y conservaron (12), probablemente por la ventaja selectiva que supone la expresión de estos genes frente al masivo uso clínico de compuestos tales como cloruro de benzalconio, acriflavina, etc. (13).

SECUENCIAS INSERTADAS

Las secuencias que pueden insertarse entre los extremos 5í y 3í CS son unos pequeños trozos de DNA, de unos pocos cientos de bases, que contienen un gen de resistencia para un antimicrobiano. Estos elementos tienen en su extremo final (3í) una secuencia de 59 pares de bases. Esta secuencia es variable tanto en la composición de sus bases como en longitud (3), aunque como consenso se toma 59 pb, ya que primero fue descubierta e interpretada como una secuencia de 59 pb imperfectamente repetidas (14). A través de estas zonas se va a producir la inserción y escisión de las IS, mediante una recombinación genética específica de sitio catalizada por la integrasa y en la que participan, además, la zona attI, o bien otro elemento de 59 pb de otra IS. En este proceso está implicado de forma más activa un triplete GTT (1, 9, 15, 16) incluido en una región de 7 bases, también denominada "core". El core es una pequeña secuencia muy conservada entre los diferentes elementos de 59 pb, que se repite al principio de las IS y al final, en la zona de 59 pb.

Normalmente estas IS no incluyen en su estructura promotores y se transcriben a partir de los promotores existentes en la región 5í CS. Para ello es necesario que estas IS se inserten siempre en la misma dirección. Se supone que las secuencias de 59 pb, implicadas en las inserciones de los genes en el interior del integrón, son las que dotan a la inserción de una direccionalidad. De de esta forma, varios de estos IS insertados uno detrás de otro pueden ser leídos a partir de los promotores comunes. En este sentido, y dado que puede haber insertados más de un gen de resistencia, cabe destacar que los genes situados en una zona más distal de los promotores tienen una expresión más baja que los situados al principio. Algunos autores proponen que esto se debe a la labilidad de los RNAm, aunque se sospecha que existen unas secuencias terminadoras de la transcripción, no muy eficaces (ya que la transcripción continúa, aunque en menor grado según nos alejamos del promotor), en la zona de 59 pb (4). De esta forma, a partir del primer gen se va perdiendo eficacia en la transcripción y expresión de los genes de resistencia.

Las nuevas IS que se inserten pueden ser incluidas tanto en la zona attI como en zonas más distales respecto de los promotores en el caso de que se produzcan recombinaciones entre dos elementos de 59 pb. En este sentido se ha demostrado que es más probable que se produzcan recombinaciones entre un elemento de 59 pb y la zona attI (15) que entre dos elementos de 59 pb. De esta forma, el gen que se inserta el último cronológicamente ocupará la primera posición, la más cercana a los promotores, y sería el más eficazmente transcrito. Estas características de las IS hacen posible que, cuando el ambiente de una bacteria cambia (debido a la presencia de antibióticos en el medio), uno de los genes que se expresa poco (lejano respecto al promotor) pueda ser intercambiado de posición pasando a posiciones más activas. En otros casos puede producirse una recombinación con otro integrón de similares características, que "done" uno de los genes que se integre en la primera posición, duplicándose por tanto en la bacteria receptora el gen integrado. En este caso se ha comprobado que existen integrones con más de una copia de iguales genes de resistencia, lo que aumenta el producto de la expresión de estos genes y, por tanto, la resistencia de las bacterias que los posean (1).

Este gran número de posibilidades de recombinación e intercambio que poseen los integrones y los genes de resistencia proporciona a las bacterias que los incluyan en su estructura una gran versatilidad para hacer frente a los antibióticos, determinando en algunos casos la eficacia de éstos (17), ya que las bacterias pueden cambiar la posición y la expresión de sus genes en función de la presión ambiental provocada por los antimicrobianos.

Por otra parte, aunque es un fenómeno no comprobado, se supone que los integrones completos pueden intercambiarse entre diferentes especies y cepas bacterianas, sin que ello suponga la transferencia total del plásmido o el transposón donde estuviera incluido el integrón. Para apoyar esta teoría se están estudiando integrones de similares características y con las mismas IS en su interior, rodeados de diferentes secuencias exteriores. Esta transferencia de integrones completos amplía aún más las posibilidades de diseminación y transferencia de los genes de resistencia entre diferentes bacterias.

TIPOS DE INTEGRONES

Los integrones a que se ha hecho referencia son los más estudiados, ya que son los que más se presentan en los aislamientos clínicos y pertenecen todos a una misma familia caracterizada porque el gen intI codifica para una integrasa de tipo I. Los pertenecientes a una subclase de éstos, con el mismo gen de la integrasa e iguales características de la región 5í CS, son los que carecen de los genes qacEAI y sulI en el extremo 3í CS. Existe, sin embargo, otra clase de integrones menos estudiados y caracterizados porque el gen int codifica para una integrasa diferente (intI 2). La secuencia de este gen comparte un 40% de similitud con el gen intI (18). Este tipo de integrasa 2 sólo se ha encontrado en el interior del transposón Tn7 y otros semejantes. Recientemente se ha detectado una tercera clase de integrón (19) cuya integrasa (intI 3) es similar en un 61% al gen de la integrasa de tipo I.

ASPECTOS CLÍNICOS

La acumulación de genes de resistencia en los integrones y por tanto en el interior de las bacterias explicaría la constante aparición de especies de enterobacterias y pseudomonas multirresistentes a una amplia variedad de antibióticos, especialmente a los aminoglucósidos. La evolución y diseminación tanto de estas bacterias como la de los propios genes de resistencia es, pues, un importante aspecto a estudiar. En este sentido, se puede determinar fácilmente mediante PCR, utilizando unos primers complementarios de unas pequeñas zonas de los extremos 3í y 5í CS, la existencia de una gran variedad de tamaños de integrones en los aislamientos clínicos. Estos tamaños oscilan entre 800 y 3900 pb dependiendo del número de genes de resistencia que transporten. El posterior análisis de la secuencia del DNA demuestra que pueden existir integrones con más de tres genes en su interior. También se ha comprobado la transferencia de estas IS entre diferentes cepas y especies de enterobacterias, y aunque la expresión de estos genes no sea la misma en unas especies que en otras, ello supone una gran ventaja como mecanismo de resistencia, como demuestra su elevada transmisibilidad y aceptación por parte de las bacterias, sobre todo en las nosocomiales. Esta gran aceptación, por otra parte, puede deberse a que no es necesario que la bacteria acumule grandes piezas de material genético como son los transposones y/o plásmidos para hacerse resistente a un determinado antibiótico, sino que con unos pequeños segmentos de DNA en el interior del integrón se alcanza la resistencia. Por otra parte, la existencia de más de un integrón en algunas bacterias, fenómeno que ya ha sido comprobado, supone una evolución de estos microorganismos para adaptarse a ambientes en los que hay más de un antibiótico.

BIBLIOGRAFÍA

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3. Recchia, G.D., Hall, R.M. Gene cassettes: A new class of mobile element. Microbiology 1995; 141: 3015-3027.
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17. Jones, M.E., Peters, E., Weersink, A., Fluit, A., Verhoef, J. Widespread occurrence of integrons causing multiple antibiotic resistance in bacteria. Lancet 1997; 349 (14): 1742-1743.
18. Hall, R.M., Vockler, C. The region of the IncN plasmid R46 coding for resistance to betalactam antibiotics, streptomycin/spectinomycin and sulphonamides is closely related to antibiotic resistance segments found in IncW plasmid and Tn21-like transposons. Nucleic Acids Res 1987; 15: 7491-7501.
19. Arakawa, Y., Murakami, M., Suzuki, K., Ito, H., Wacharotayankun, R., Ohsuka, S., Kato, N., Ohta, M. A novel integron-like element carrying the metallo betalactamase gene blaIMP. Antimicrobial Agents Chemother 1995; 39: 1612-1615.