Interacciones de las bacterias y el antimicrobiano durante la fase de efecto postantibiótico

La interacción de los microorganismos y los antimicrobianos es un tema complejo que actualmente está siendo estudiado con detalle. La unión del antimicrobiano a las estructuras bacterianas, de forma reversible, desencadena una serie compleja de alteraciones y modificaciones en la célula, tanto fisiológicas como morfológicas, haciendo que la bacteria superviviente no recobre su funcionamiento normal hasta pasado un tiempo más o menos largo, en comparación con las bacterias que no han sido tratadas. Así, las células expuestas a la acción del antimicrobiano pierden su capacidad de multiplicación durante varias horas después de que el antimicrobiano haya sido eliminado, a la vez que experimentan una serie de alteraciones ultraestructurales que afectan a su morfología y funcionalidad enzimática normal. La recuperación de estas funciones dependerá de varios factores, siendo los más importantes la concentración de antimicrobiano y el tiempo de exposición (1-9).

El estudio de las interacciones de las bacterias y los antimicrobianos no es nuevo; las primeras observaciones de este fenómeno datan de los años 1940. Bigger, en 1944 (10), fue el primero en demostrar que las bacterias grampositivas, tras ser expuestas a la acción de la penicilina, no recobraban su crecimiento normal hasta transcurridas algunas horas después de haber sido eliminado el antibiótico. Posteriormente, Bundtzen (11) lo denominó efecto postantibiótico (EPA), definiéndolo como el retraso del crecimiento bacteriano que se manifiesta después de una breve exposición de la bacteria al antimicrobiano. Durante los años siguientes al descubrimiento del EPA ésta fue la definición clásica y su determinación se realizaba mediante el recuento de células viables descrito por Bundtzen, utilizándose como método de referencia. Más tarde, otros autores han desarrollado distintos métodos para la determinación del EPA (11). Básicamente todos consisten en medir el recrecimiento bacteriano una vez que se ha eliminado el antimicrobiano, diferenciándose entre ellos en la forma de medir dicho crecimiento. Generalmente estas técnicas se pueden englobar en tres grupos:

1) Las basadas en la medida del crecimiento en sí por distintos procedimientos: recuento de células viables, bioluminiscencia (12, 14), espectrofotometría (15, 16), conductancia eléctrica (17, 18), producción de CO2 en el medio (19) o por incorporación de isótopos radiactivos (20-22).

2) Las basadas en la observación de los cambios morfológicos (forma de las bacterias, grosor de la pared celular) (23-29).

3) Las basadas en cambios fisiológicos de la célula (producción de enzimas, betalactamasas, hemolisina, etc.) (30-59).

Cuando la técnica se basa en los cambios morfológicos se ha utilizado el término EPA morfológico, y en este caso el EPA es el tiempo que tarda la bacteria en recuperar su forma habitual una vez se ha eliminado el antimicrobiano (23-29). Cuando la determinación está basada en los cambios fisiológicos o en la inhibición de la actividad enzimática ha recibido distintos nombres, dependiendo del parámetro que se éste midiendo: disminución en la producción de betalactamasas (Post-beta-Lactamase Inhibitor Effect, PLIE) (58), aumento de la sensibilidad a la acción de los leucocitos polimorfonucleares humanos (Post-Antibiotic Leucocyte Enhancement, PALE) (32, 45, 51-55, 57) o aumento de la sensibilidad bacteriana a la acción de concentraciones subinhibitorias (Post-Antibiotic Sub-MIC Effect, PASME) (46-49). Todos los métodos basados en la medida del crecimiento bacteriano tienen una buena correlación con el método de referencia descrito por Bundtzen; sin embargo, cuando se miden las alteraciones morfológicas o fisiológicas el EPA suele ser más largo que el de referencia, lo cual evidencia que la primera función que recupera la bacteria después de una breve exposición al antimicrobiano es su capacidad de multiplicarse, y que el resto de las funciones estudiadas permanecen alteradas varias horas después de haber comenzado su recrecimiento normal.

ALTERACIONES ULTRAESTRUCTURALESEN LA BACTERIA

La observación de las bacterias por microscopía electrónica, durante el tiempo que dura la fase EPA, ha puesto de manifiesto que las células están alteradas morfológicamente, adoptando formas globosas o filamentosas, después de la exposición al antimicrobiano (23-29). Estas alteraciones difieren según el binomio bacteria-antimicrobiano y se producen incluso a concentraciones subinhibitorias (27).

Los macrólidos producen un engrosamiento en la pared celular de Staphylococcus aureus durante la fase EPA que puede permanecer hasta dos a cuatro horas después de haber eliminado el antimicrobiano y hasta más de 40 minutos tras haber comenzado el recrecimiento de la bacteria (28, 29).

Los betalactámicos inducen, en las bacterias gramnegativas, la filamentación o el hinchamiento de las células dependiendo del antimicrobiano y de su afinidad por las proteínas de la membrana bacteriana (PBP). Los betalactámicos con gran afinidad por las PBP3 causan la formación de filamentos (las PBP3 son esenciales para la formación de los septos), y los que tienen afinidad por las PBP2 inducen la formación de esferoblastos (26). Hanberger (26) estudió la relación entre la alteración morfológica producida por diversos betalactámicos y la duración del EPA en bacterias gramnegativas, observando que con los que producen EPA mayores de una hora predominan las células globoides, mientras que con los que inducen EPA inferiores a una hora aparece un mayor número de filamentos. En ambos casos la alteración morfológica persiste durante varias horas después de haber comenzado la multiplicación de las bacterias. El EPA de los betalactámicos determinado por la observación microscópica representa el tiempo que tarda la bacteria en resintetizar la pared bacteriana normal o en iniciar la reseptación.

Los aminoglucósidos, como la gentamicina, producen pocos cambios en la morfología de S. aureus, pero causan la aparición de agregados electrodensos en bacterias gramnegativas tales como Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli (24).

El ciprofloxacino produce una hinchazón de las bacterias con formación de vacuolas en el citoplasma en la mayoría de los S. aureus durante la fase EPA. Inmediatamente después de la eliminación del antimicrobiano se observan dos patrones estructurales, uno formado por unas pocas células pequeñas con citoplasma electrodenso, que representaría a las células no dañadas, y otro formado por un gran número de células anormalmente hinchadas que representan a las bacterias dañadas (25). Esto indica que las modificaciones en la forma de la bacteria no son uniformes en todos los microorganismos tratados y que la acción antimicrobiana probablemente es un efecto individual, que afecta al microorganismo en diferentes grados y no a toda la población. Esta diferencia se debe a que la población bacteriana está formada por bacterias en distintas fases de crecimiento durante la exposición al antimicrobiano.

Sobre los microorganismos gramnegativos, como P. aeruginosa y E. coli, el ciprofloxacino induce la formación de células globoides que no revierten a su estado estructural normal hasta pasados más de 180 minutos desde el recrecimiento normal de la bacteria (60).

La rifampicina y la trimetoprima producen en S. aureus la aparición de estructuras similares a mesosomas, lo que se ha interpretado como un incremento en la actividad de la síntesis de DNA en relación con una represión de la síntesis de RNA durante la fase EPA, ya que los mesosomas participan en la replicación del DNA y en la división celular (24).

ALTERACIÓN DE LOS FACTORESDE VIRULENCIA BACTERIANA

La virulencia bacteriana es una reacción que resulta de la interacción de la bacteria y su hospedador. Cuando un antimicrobiano interacciona con una bacteria altera sus características fisiológicas haciéndola más vulnerable al sistema de defensa inmunitario del hospedador. Los factores de virulencia que se ven afectados son la actividad hemolítica, la adherencia, la hidrofobicidad de la superficie celular, la invasión tisular, la producción de productos metabólicos celulares (toxinas y sustancias o enzimas degradantes de antibióticos) y la sensibilidad a la acción bactericida de los leucocitos humanos.

Actividad hemolítica

Algunas bacterias producen hemolisinas, enzimas que inducen la liberación de hemoglobina de los eritrocitos del hospedador. La acumulación de hemoglobina, liberada desde el interior de los eritrocitos, se conoce con el nombre de actividad hemolítica y puede ser medida por espectrofotometría.

Las bacterias productoras de hemolisinas tienen inhibido durante la fase EPA el sistema productor de estas enzimas. La producción de concentraciones normales se logra después de varias horas de haber recuperado el crecimiento normal de la bacteria.

La alteración de la actividad hemolítica de las bacterias durante la fase EPA se ha estudiado, principalmente, con los macrólidos sobre los estreptococos y con las quinolonas sobre E. coli (37, 55).

Adherencia celular

La proliferación y la adherencia de las bacterias sobre los sistemas biológicos de su hospedador también se ven afectadas tras verse expuestas a la acción de los antimicrobianos. Schmitt y cols. (56) observaron que la adherencia y la colonización sobre prótesis vasculares de Staphylococcus epidermidis expuesto a la acción de la rifampicina disminuye considerablemente durante la fase EPA. Este hecho también se ha observado con enoxacino y CI-960 sobre E. coli (38). Esto es muy importante a la hora de realizar trasplantes en humanos, ya que tratando al paciente antes de la intervención con una dosis de antimicrobiano capaz de inducir un EPA más o menos largo disminuye considerablemente la colonización de la zona y de la prótesis implantada.

Hidrofobicidad de la superficie celular

La hidrofobicidad de la superficie celular de los estreptococos tratados con algunos macrólidos ha sido estudiada por Ramadan y cols. (55), que han observado como ésta disminuye considerablemente durante la fase EPA.

Producción de toxinas

La síntesis de los factores de virulencia en P. aeruginosa, tales como proteasas y exotoxina A, se ve considerablemente reducida después de la exposición a concentraciones subinhibitorias de ciprofloxacino. El grado de inhibición en la producción de proteasas es dependiente de la cepa (37).

Producción de enzimas degradantesde antimicroblanos

La producción de enzimas degradantes de antimicrobianos, tales como las betalactamasas, también se ve inhibida durante la fase EPA. Waters estudió el EPA y la producción de betalactamasas en Moraxella catarrhalis después de ser expuesta a la ampicilina y al ácido clavulánico (58). Observó que los cultivos, después de ser expuestos a estos antimicrobianos, no empezaban a producir betalactamasas hasta varias horas después de recuperado el recrecimiento normal de las bacterias. Este retraso en la producción normal de betalactamasas lo denominó PLIE (Post b-Lactamase Inhibitor Effect).

Sensibilidad a la acción bactericidade los leucocitos polimorfonucleares humanos

McDonald y cols., en 1981 (42), fueron los primeros en observar que los microorganismos, después de ser tratados con un antimicrobiano, son más sensibles a la actividad bactericida de los leucocitos humanos, denominando a este fenómeno PALE (Post Antibiotic Leucocyte Enhancement). La duración de este efecto depende de la combinación antimicrobiano-microorganismo (32, 45, 51-53, 55, 57). Una explicación de este fenómeno podría estar relacinada con las modificaciones producidas por el antimicrobiano sobre la superficie de la bacteria.

ACUMULACIÓN DE LOS ANTIMICROBIANOSEN EL INTERIOR DE LAS BACTERIAS

Las bacterias pueden resistir los efectos nocivos de los antimicrobianos gracias a un sistema de expulsión o "achique" de éstos, evitando con ello su acumulación en el interior de la bacteria. Este mecanismo de expulsión puede ser un sistema dependiente de energía o tratarse de un transporte pasivo. En el caso de los macrólidos y las quinolonas, la expulsión del antimicrobiano requiere energía (25).

La acumulación normal de los antimicrobianos en el interior de las bacterias también se ve afectada durante la fase EPA. Esta alteración depende, principalmente, del modo de acción del antimicrobiano y de la combinación antimicrobiano-microorganismo. Así, varios autores han observado que la acumulación de las quinolonas aumenta considerablemente durante la fase EPA en comparación con las células no tratadas en fase activa de crecimiento (44, 61). Ello se debe a que después de la exposición al antimicrobiano las bacterias tienen reducido su metabolismo y no son capaces de generar suficiente energía para expulsar al antimicrobiano de la célula. Por el contrario, la acumulación de gentamicina en el interior de P. aeruginosa disminuye significativamente durante la fase EPA. En ambos casos, los efectos del antimicrobiano sobre el sistema de expulsión y acumulación duran varias horas más que la recuperación del crecimiento bacteriano.

MODIFICACIÓN DE LA SENSIBILIDAD BACTERIANA

Otro de los fenómenos relacionados con la exposición de las bacterias a un antimicrobiano es la modificación de su sensibilidad. Puede ocurrir que las bacterias, después de haber sido sometidas a concentraciones elevadas de antimicrobiano, sean más sensibles o por el contrario se muestren más resistentes a posteriores concentraciones de los fármacos.

Aumento de la sensibilidad bacteriana

Durante la fase EPA las bacterias se muestran mucho más sensibles a posteriores y repetidas exposiciones a los mismos antibióticos. De esta forma, concentraciones muy por debajo de las mínimas inhibitorias pueden inducir retrasos en el crecimiento bacteriano de varias horas de duración si la bacteria ha sido sometida a concentraciones elevadas del antimicrobiano. Este fenómeno ha sido denominado PASME (Post Antibiotic Sub-MIC Effect) (46-49). Aunque es un efecto que ocurre principalmente con los antibióticos betalactámicos, también se han observado largos PASME con otros antimicrobianos como los aminoglucósidos, los glucopéptidos y las quinolonas, tanto sobre bacterias grampositivas como gramnegativas (30, 31, 40, 41, 43, 46-50, 60). El mecanismo por el cual se produce este PASME no se conoce muy bien. Según Odenholt, cuando la bacteria ha sido dañada por concentraciones elevadas de antimicrobiano, una pequeña cantidad de éste es suficiente para inducir un nuevo y más prolongado retraso del crecimiento normal.

Disminución de la sensibilidad bacteriana

Algunas bacterias, después de ser sometidas a un antibiótico, se muestran durante un periodo de tiempo determinado mucho más resistentes a la acción de nuevas concentraciones de antimicrobiano. Es decir, la actividad bactericida de algunos antimicrobianos sufre una importante reducción durante la fase EPA en aquellas bacterias que han sido previamente expuestas. A este fenómeno se le conoce como resistencia adaptativa (33, 35, 39). La existencia y duración de esta fase de resistencia adaptativa depende principalmente del antimicrobiano (se ha observado en los aminoglucósidos y las quinolonas, pero parece no afectar a los betalactámicos), de la concentración de antibiótico y de la duración de la primera exposición. El mecanismo de esta resistencia bacteriana puede deberse a una reducción del transporte de antimicrobiano hacia el interior de la célula. Según Karlowsky (39), esta adaptación de la bacteria se debe a una selección de subpoblaciones genotípicamente resistentes que aparecen después de una primera exposición al antimicrobiano.

Revisados los métodos propuestos para medir el EPA se deduce que todas las técnicas basadas en la multiplicación bacteriana coinciden en la medida y son más cortas que las que utilizan otros parámetros, como son la morfología bacteriana o la síntesis de DNA o de proteínas, o la producción de enzimas, etc. Esto indica que la primera defensa de la bacteria ante la acción del antibiótico es la inhibición de la división celular para evitar transferir el daño a la descendencia, y también que la capacidad de dividirse es lo primero que se recupera (62).

La clásica y nombrada definición de Bundtzen (11) únicamente mide la recuperación de la división celular. El término "efecto postantibiótico" debe incluir todos los fenómenos relacionados con la exposición al antimicrobiano, como son las alteraciones estructurales y de los factores de virulencia, la acumulación en el interior de la bacteria, la modificación de la sensibilidad bacteriana, etc., y no sólo el retraso del crecimiento. Las propuestas de otros autores de medir el EPA mediante la síntesis de proteínas o de DNA, o por la morfología bacteriana, no es que sean más exactas, sino que demuestran la cascada de reacciones y acontecimientos que se producen tras una breve exposición de la bacteria a la acción del antimicrobiano. El tipo y los daños producidos dependerán del antimicrobiano, de su modo de acción y del microorganismo sobre el que actúa, aunque en ocasiones, antimicrobianos con modos de acción muy diferentes pueden afectar a una misma enzima o proteína y provocar la misma reacción en la bacteria. Una vez terminada la fase EPA (entendida como recuperación de la división celular) la bacteria no ha recuperado totalmente todas sus funciones.

La clásica definición del efecto postantibiótico como "la persistencia en la inhibición de la división bacteriana después de una corta exposición al antimicrobiano" debería ampliarse y definirse como "el tiempo que tarda la bacteria en recuperar todas las funciones alteradas" por una breve exposición al antimicrobiano. Sería interesante determinar en una misma cepa todas las funciones que se alteran (división celular, morfología, producción de enzimas y proteínas esenciales, factores de virulencia, sensibilidad a la acción de los leucocitos PMN, etc.) y medir el tiempo que tarda en recuperarlas. La duración efectiva del EPA sería el tiempo que tarda en recuperar la última de las funciones alteradas.

El estudio de las interacciones de las bacterias y los antimicrobianos, incluidas cinéticas de letalidad, así como el tiempo necesario para la recuperación de todas las funciones afectadas por el tratamiento con un fármaco, pueden servir para conocer mejor el mecanismo de acción de éste y quizás también las posibles resistencias cruzadas entre antimicrobianos con diferente modo de acción (9).

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